超分辨顯微鏡工作原理的詳細(xì)介紹：對(duì)于傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡，光的衍射讓成像分辨率限制在大約250 nm。如今，超分辨率技術(shù)可以將此提高10倍以上。這種技術(shù)主要通過(guò)三種方法實(shí)現(xiàn)：?jiǎn)畏肿佣ㄎ伙@微鏡，包括光敏定位顯微鏡（PALM）和隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（STORM）；結(jié)構(gòu)照明顯微鏡（SIM）；以及受激發(fā)射損耗顯微鏡（STED）。

如何選擇超分辨率技術(shù)，這是大家都關(guān)心的。“不幸的是，并沒(méi)有簡(jiǎn)單的原則來(lái)決定使用哪種方法，”英國(guó)牛津大學(xué)的博士后研究員Mathew Stracy說(shuō)。“每一種都有其自身的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。”

科學(xué)家當(dāng)然也在想辦法，為特定的項(xiàng)目選擇合適的方法。以色列理工學(xué)院的助理教授Yoav Shechtman表示：“在生物成像的背景下，要考慮的關(guān)鍵因素包括：空間和時(shí)間分辨率、對(duì)光損傷的敏感性、標(biāo)記能力、樣本厚度，以及背景熒光或細(xì)胞自體熒光。”

工作原理

各種超分辨顯微鏡是以不同的方式工作的。以PALM和STORM為例，在特定時(shí)刻，只有一小部分熒光標(biāo)記激發(fā)或光活化，使得它們能夠高精度地獨(dú)立定位。讓所有熒光標(biāo)記都經(jīng)歷這個(gè)過(guò)程，這也就帶來(lái)了一幅完整的超分辨率圖像。2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的獲得者之一、馬普生物物理化學(xué)研究所主任Stefan Hell表示：“PALM/STORM系統(tǒng)相對(duì)容易搭建，但比較難以應(yīng)用，因?yàn)闊晒饣鶊F(tuán)要具有光活化能力。局限之處在于它們需要檢測(cè)細(xì)胞背景下的單個(gè)熒光分子，在可靠性上不及STED。”

STED使用激光脈沖來(lái)激發(fā)熒光基團(tuán)，并使用環(huán)形的激光來(lái)淬滅熒光基團(tuán)，只留下中間納米大小的熒光而得到超高分辨率。掃描整個(gè)樣本，可生成一幅圖像。“STED的優(yōu)勢(shì)在于它是一種按鈕技術(shù)，”Hell解釋說(shuō)。“它用起來(lái)就像標(biāo)準(zhǔn)的共聚焦熒光顯微鏡。”它還可以利用一些熒光基團(tuán)對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行成像，比如綠色或黃色的熒光蛋白和羅丹明衍生染料。